纳米孔单分子检测技术于30年前被提出并得到快速的发展，基于纳米孔的DNA测序商品仪器已问世多年。目前，研究人员正拓展该技术用于蛋白质/多肽识别、miRNA检测、酶活性鉴定、分子构象识别等领域。生物纳米孔就是一个由氨基酸有序排列组成的蛋白质分子的纳米孔道，目标分子进入纳米孔道时将诱导时序性的离子流变化，从而获取孔道内部单个分子的信息，因此，孔道内的离子流变化是纳米孔道传感的基础与核心，并实质上决定了纳米孔道的传感灵敏度及其应用范围。待测分子诱导的离子流阻断通常被认为主要由其在纳米孔道内排开溶液体积造成，然而，实验中频繁出现的离子流阻断与排阻体积的不一致性时常困扰着研究者;同时，现有的对孔道内离子流阻断的这一理解也限制了该技术在单分子蛋白质测序、复杂体系中生物标志物识别中的应用和发展。因此，对纳米孔道内离子流传感信号重新从电化学源头认识至关重要。

图1. 相互作用决定单个甲基差异诱导Aerolysin纳米孔道内离子流阻断增强

近日，南京大学研究院生命分析化学国家重点实验室龙亿涛课题组重新审视并提出了纳米孔道内离子流传感的来源：待测物在孔道内的排阻体积与其和孔道之间的相互作用协同决定了离子流信号的特征。该工作首先从理论角度揭示了纳米孔道与目标分子之间的非共价相互作用，包括静电相互作用、范德华相互作用、氢键等通过影响孔道内的离子迁移率，从而改变孔道内未被目标分子占位部分的溶液电导，以乘积的形式在体积排阻的基础上诱导离子流传感信号的增强。同时，在实验验证方面，基于单个甲基差异的DNA片段在Aerolysin生物纳米孔道中诱导的增强的离子流信号，结合溶液电导理论和纳米孔道实验，证实了甲基化DNA与Aerolysin的相互作用在增强离子流信号中的重要性，并对其在离子流信号增强中的贡献进行了定量化。

图2. 分子动力学模拟揭示相互作用差异

通过分子动力学模拟，进一步揭示了Aerolysin识别甲基化DNA/正常DNA的主要区域，证明了其与甲基化DNA/正常DNA差异的相互作用，并通过具体解析孔道内各个氨基酸位点与DNA的各种非共价相互作用，提出了Aerolysin基于相互作用识别DNA上单个甲基基团的机制。同时，通过巧妙设计Aerolysin上的突变以定向调控非共价相互作用类型及大小，证实了非共价相互作用协同体积排阻对离子流信号的”倍增”效应。

图3. 定向设计特定氨基酸相互作用调控识别能力

该研究成果以“Revisiting the Origin of Nanopore Current Blockage for Volume Difference Sensing at the Atomic Level”为题，发表于JACS Au(DOI：10.1021/jacsau.1c00109，文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.1c00109), 南京大学化学和生物医药创新研究院的博士后李孟寅为论文第一作者，龙亿涛教授为通讯作者。此项研究得到了国家自然科学基金重大项目“基于纳米孔道电荷传输的单分子单细胞精准测量”和中国博士后科学基金等经费资助。